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實際上，從色譜柱到色譜柱的重現性應該比較好的。即使是批次間的重現性也應比您觀察到的要好。如果您從信譽良好的生產商處購買色譜柱，則批次間的重現性應優于±10%，甚至優于±5%。您是否調查過兩個色譜柱是否均使用同一批填料制備?
問：我有兩個來自同一制造商的相同類型的反相C18色譜柱，它們的保留時間差異很大(40%)。問題是什么?
答：這顯然是一個嚴重的問題。相同填料的色譜柱之間的保留時間重現性應比較好，一搬在±5%的范圍內。對于更高質量的填料，保留時間的重現性約為±2%，但是要達到這個重現性水平，還需要良好的溫度控制。知道了這一點，您的這個色譜柱的重現性結果顯然是不可接受的。讓我們調查一下可能出現的問題。首先，讓我問一個問題：是否其中一根色譜柱使用次數較多?發現新舊色譜柱之間保留時間的差異并不少見。如果使用的舊色譜柱接近鍵合相pH值穩定性的極限，則尤其要注意。同樣，如果樣品中的某些成分長時間累積在色譜柱上，則觀察到保留時間出現變化也很常見。樣品保留成分的積累會導致保留率的急劇變化。在這種情況下，有必要選擇一下合適的清洗方案，從色譜柱中除去該樣品保留成分。那么，這兩根色譜柱中的哪一根使用的多?
問：都不是!兩根色譜柱都是新的，剛從色譜柱盒中取出來使用的。我希望從全新的色譜柱上獲得更好的重現性。
答：實際上，從色譜柱到色譜柱的重現性應該比較好的。即使是批次間的重現性也應比您觀察到的要好。如果您從信譽良好的生產商處購買色譜柱，則批次間的重現性應優于±10%，甚至優于±5%。您是否調查過兩個色譜柱是否均使用同一批填料制備?
問：是的，我調查過，生產商確定這兩根色譜柱是同一批填料生產的。
答：這使得保留時間差異變得更難以理解。目前看來兩柱子之間的唯一區別是填充過程。色譜柱的填充過程具有足夠的可重復性，填充密度的變化不會超過±2%，因此，保留時間的變化不應超過±2%。即使將流動相組成的不確定性加上包裝過程的不確定性考慮進去，仍無法解釋您所觀察到的較大的保留時間差異。
通常，流動相配比時的錯誤可能是對您的觀察結果的解釋。如果流動相的有機相含量變化1%，則保留時間差異可能為10%。另一方面，在許多情況下，高達20%的流動相緩沖液濃度差異會導致保留時間差異僅為1%。另一種可能是流動相pH值有些誤差。如果待測物的pKa接近流動相緩沖液的pH值，則pH值變化0.1個單位會導致保留時間差異為10%。因此，必須仔細檢查流動相的pH值。
其他外部影響不太明顯。柱溫變化每5oC會影響約10%的保留時間的變化。因此，柱溫變化不太可能是造成這個問題的原因。如果流動相中含有離子對，通常會在色譜柱尚未完全與流動相平衡時使用。用離子對試劑時，平衡色譜柱通常需要幾百毫升的流動相，特別是當流動相中離子對試劑的濃度較低時。
其他的外部影響則不那么明顯，溫度變化每5oC影響近似10%，因此，溫度的變化不太可能是導致你的問題的原因，如果您正在處理離子對分離，在不知不覺中使用尚未與移動階段完全平衡的色譜柱并不罕見。通常需要100mL移動用離子配對試劑平衡該柱，特別是在離子配對試劑的移動相濃度較低的情況下。
問：我沒有使用離子對試劑。另外，補充說明，兩個色譜柱均使用相同的流動相進行了驗證，(這種差異)結果是可重復的。這不包括您剛才描述的影響，不是嗎?
答：這使得解釋變得更加困難，在開始測試之前如何處理色譜柱?
問：兩者的處理方式完全相同。我把它們從盒子里拿出來，用流動相平衡了它們。
答：嗯...現在變得越來越困難。總而言之，我們有兩個新色譜柱，它們是用同一批次的填充材料制備的，卻得到截然不同的色譜結果。唯一合理的解釋是，色譜柱平衡存在一些差異，導致保留時間發生這些變化流動相中有機溶劑的濃度是多少?
問：流動相幾乎是100%的水溶液。它由98%的緩沖液和2%的甲醇組成。我從包裝盒中取出色譜柱，并在開始注入樣品前用流動相平衡了一個小時。
答：現在我們越來越近了。流動相中有機溶劑的濃度低，保留時間差異是由于色譜柱的潤濕性差異引起的。疏水性強，封端良好的C18色譜柱的保留時間可能會有所不同，這取決于它們所經歷過的事情。如果兩根色譜柱之一在運輸過程中意外干燥或部分干燥，則其保留時間會比完全浸潤的C18色譜柱小很多。這是因為，水和含水量很高的流動相不能很好地浸濕疏水性C18的表面。因此，當使用含水量高的流動相時，只有C18填料的一部分可用于保留。因此，保留因子顯著低于在浸潤良好的色譜柱上的保留因子。您可以通過先用100%甲醇重新浸潤色譜柱，然后再用流動相重新平衡來解決該問題。該“再潤濕”步驟可確保填料的整個表面都與待測物發生相互作用。對兩個色譜柱都執行完此操作后，保留時間即可重現，也許會接近1%。根據問題的描述以及我們已經消除了所有其他可能性的事實，我非常確定這是造成保留時間問題的原因
