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峰形問題是反相色譜分析中最常遇到的問題之一。造成峰形問題的原因有很多，本文重點討論在反相色譜中由于稀釋劑與初始流動相的差異造成的峰形問題，也就是常說的“溶劑效應”及其內在原因和應對方法。
1. 為什么我們需要好的色譜峰形?
色譜分析是一種非常追求準確度的分析手段，理想的峰形是高斯(Gaussian)峰形，也就是呈正態(tài)分布，左右對稱。但是在實際情況下，色譜峰或多或少都會有點前延(fronting)或者拖尾(tailing)，甚至完全不成單峰等，這樣不僅影響分析人員看到圖譜時的心情，也會降低色譜峰的靈敏度、峰面積的積分準確度以及色譜峰之間的分離度。
圖1 高斯峰形示意圖
2. 什么是理想的樣品稀釋劑?
在分析HPLC中，往往建議稀釋劑為起始流動相(但在制備HPLC中，使用比流動相更弱的稀釋劑更利于更大的進樣體積)，以避免對分離分析產生不利影響。但是在實際的工作中，樣品的預處理往往使得其稀釋劑和起始流動相有了很大的差異，也有一些分析方案中會建議通過蒸發(fā)除去樣品預處理中的溶劑后再用起始流動相溶解樣品。但是這種額外的步驟很費時間，甚至超過了HPLC分析的時間，只有在萬不得已的時候才選擇。也有基于其他考慮(如溶解性、樣品穩(wěn)定性等)而選擇和流動相不一致的溶劑作為稀釋劑。但是不管是何種稀釋劑，只要能穩(wěn)定溶解足夠的樣品，且對峰形等不會產生不利影響，就是理想的稀釋劑。
3. 溶劑效應的原因有哪些?如何應對?
3.1 稀釋劑與流動相的洗脫強度不匹配
當稀釋劑的洗脫強度強于起始流動相時，也就是有機相(%B)的比例高于流動相時，我們可以估算出保留的改變(Δk)：
其中S和每種溶質的特性有關，S ≈ 0.25 MW0.5，MW為分子量。如果我們選擇了一種典型的400 Da的小分子，當B%變化10%(即Φ=0.1)時，S ≈ 0.25×4000.5=5，Δk ≈ 105×0.1 ≈ 3.2。這意味著B相的10%的增加或者降低會導致三倍的的保留因子K的降低或者增加，也就是常說的“三倍規(guī)則”。如果一個樣品的稀釋劑比流動相強，進樣的溶液在跑過柱子的過程中，它會和流動相以相同的流速移動，但是其中的樣品分子的移動速度會比溶解在流動相時更快，進樣成分會被流動相逐漸稀釋直到和流動相完全一致。我們把進樣的液體形象地稱為“樣品塞”，緊跟“樣品塞”的流動相會稀釋它，因此尾部的溶質分子的前進速度會慢下來，以正常的洗脫速度前進。雖然這些過程發(fā)生的速度很快，但是如果稀釋劑足夠強、進樣體積足夠大，還是會有明顯的峰展寬。
Dolan作了圖來更加直觀地說明這種現(xiàn)象，在圖2中每個水平放置的長條代表充滿流動相(用小圓黑點表示)的色譜柱。在上面三個例子中，進到流動相的樣品用棋盤格表示，隨著時間的流逝從狀態(tài)A逐步變到狀態(tài)B和C，樣品流經色譜柱，發(fā)生了稍微的峰展寬。在下面三個例子中，樣品溶解在更強的溶劑中(斜線表示)，A'為剛進樣后的狀態(tài)，“樣品塞”占據(jù)的體積和A一樣，因為進樣量相同;在B'中，由于“樣品塞”里的溶劑比流動相更強，溶解其中的樣品分子會以比正常情況更快的速度通過色譜柱，與此同時尾部被流動相稀釋的部分溶質分子的通過速度降低至正常速度(棋盤格部分)，這樣即使“樣品塞”更窄(也就是進樣量更少)，由于前后端的稀釋，樣品擴散的空間也會更大;在C'中，“樣品塞”基本都被稀釋了，但是峰展寬一直在發(fā)生，直到所有樣品都溶解在流動相中。
圖2 以流動相為稀釋劑(A，B，C)和以更強的溶劑為稀釋劑(A'，B'，C')時的“樣品塞”在色譜柱中的運動情況示意圖
在某些更極端的條件下，稀釋劑的強度太大還可能導致色譜峰出現(xiàn)裂分甚至完全不成峰形。
當由于稀釋劑由于和流動相的溶劑強度不匹配而造成峰形異常時，該如何應對?
1. 降低稀釋劑的洗脫強度;
2. 降低樣品的進樣體積。進樣體積越小，樣品就越容易被流動相稀釋掉。Dolan實驗室嘗試過在反相流動相中進樣1 μL以甲苯為溶劑的樣品時，可以得到滿意的結果。
但是稀釋劑與流動相的洗脫強度不匹配并不能解釋所有情況。比如Tseing和Roger發(fā)現(xiàn)分析二羥基苯的異構體時，不管是將甲醇作為稀釋劑，水作為流動相還是水作為稀釋劑，甲醇作為流動相，最終都得到雙峰，但是當稀釋劑和流動相一致時，就可以得到單峰;Zapata和Garrido也發(fā)現(xiàn)在分析葉綠素時，當使用丙酮-水(69:31)為稀釋劑，甲醇-水(95:5)為流動相時，雖然兩者洗脫強度一致，但是葉素綠的峰為多峰。經過研究后發(fā)現(xiàn)這和稀釋劑與流動相之間的黏度不匹配有關。
3.2 稀釋劑與流動相的黏度不匹配
當稀釋劑與流動相之間的黏度不一致時，會發(fā)生黏性指進(viscous fingering)這種流體力學不穩(wěn)定現(xiàn)象。也就是低黏度的溶劑會如伸出手指一般向高粘度滲透，同時這種滲透是隨機的，不可預測。如圖3，黑色部分就是低黏度的溶劑，在更高粘度的背景溶劑中如樹枝般隨機“生長”。
圖3 一種黏性指進的圖
在色譜分析中，稀釋劑與流動相的黏度不匹配對譜圖的影響不僅與稀釋劑與流動相黏度的不匹配程度有關，也與樣品溶質及樣品溶劑的遷移速度有關。當黏度差異相同時，樣品的溶質與溶劑在越短的時間內洗脫，且洗脫時間越接近時，對峰形的不利影響就越明顯，這種現(xiàn)象在體積排阻色譜(SEC)中比較常見。
正如上面提到的這種“黏性指進”是隨機的，因此往往連續(xù)進樣時峰形不能重現(xiàn)(如圖4)，這也是判斷到底是黏性不匹配還是上面所說的洗脫強度不匹配的重要依據(jù)。
圖4 三次連續(xù)進樣的疊加圖(稀釋劑為70% MeOH，流速為0.5 mL/min)，右上角的圖為用流動相為稀釋劑的圖
當由于稀釋劑由于和流動相的黏度不匹配而造成峰形異常時，該如何應對?
1. 嘗試用初始流動相稀釋樣品，但這往往是正確的廢話，因為很多情況是不能或不便用初始流動相稀釋樣品;
2. 降低進樣量;
3. 選擇更大的定量環(huán)，也就是增強在定量環(huán)中的預混，如圖5。同樣進樣10 μL或者20 μL，當增加定量環(huán)的大小(從10 μL到20 μL或者從20 μL到50 μL)時，峰形可以明顯改善。
圖5 不同稀釋劑和定量環(huán)時的峰形疊加圖(流動相為60% MeOH，流速1 mL/min)
4. 升高溫度，可以在某些區(qū)間內拉平稀釋劑和流動相之間的黏度差異，從而減少其不良影響，這在體積排阻色譜(SEC)中很常見;
5. 在半制備或者制備色譜中，常常增大進樣量以提高效率，有時候由于溶解性問題也讓使用起始流動相作為稀釋劑不太現(xiàn)實，為了降低稀釋劑和流動相由于黏度不匹配而造成分離的不良影響，強烈建議調節(jié)兩者的黏度，一種可能的解決方案是在低黏度的一方中加入極少量的高黏度溶劑，比如DMSO或者環(huán)己醇。
3.3 稀釋劑與流動相的pH不匹配
我們在分析可離子化的化合物時，常常會基于分析物的pKa選擇不同pH的流動相，以實現(xiàn)最佳的分離效果。在很多情況下，樣品稀釋劑和流動相的pH并不一致，甚至相差好幾個單位，比如樣品在起始流動相條件下不穩(wěn)定時，首先就應該考慮樣品的穩(wěn)定性。當稀釋劑與流動相的pH不一致時，稀釋劑在流經色譜柱時，會改變周圍環(huán)境的pH，從而可能改變分析物的電離狀態(tài)進而影響其保留行為。
為了更加直觀地了解當樣品稀釋劑對流動相pH的影響，Stoll在HPLC系統(tǒng)中設計了一個pH的在線監(jiān)測系統(tǒng)，可以實時測定色譜柱入口和色譜柱出口的pH值。實驗中選擇的苯甲酸為分析物，樣品稀釋劑為乙腈：1 mM或100 mM磷酸鹽(pH 7)=13:87，流動相為乙腈：100 mM磷酸鹽(pH 3.2)=23:77，色譜柱為50×4.6 mm的C18柱，流速為2 mL/min(其他詳細色譜條件見參考文獻[6])。圖(a)為稀釋劑中緩沖劑為1 mM pH 7的緩沖鹽時，不同進樣量時色譜柱入口處的pH隨時間的變化圖;圖(b)為稀釋劑中緩沖劑為100 mM pH 7的緩沖鹽時，不同進樣量時色譜柱入口處的pH隨時間的變化圖;圖(c)為稀釋劑中緩沖劑為1 mM pH 7的緩沖鹽時，不同進樣量時色譜柱出口處的pH隨時間的變化圖;圖(d)為稀釋劑中緩沖劑為100 mM pH 7的緩沖鹽時，不同進樣量時色譜柱入口處的pH隨時間的變化圖。其中藍、紫、綠、紅、粉曲線分別是進樣量為1 μL、5 μL、15 μL、30 μL、100 μL的pH曲線圖。
圖6 進樣不同濃度和體積的稀釋劑時色譜柱入口和出口處的pH圖
在色譜柱入口端：
從圖(a)可以看出，即使稀釋劑中的緩沖劑為1 mM的磷酸鹽，當進樣量為30或100 μL時也會在流動相中產生pH>5的區(qū)域，而當稀釋劑中的緩沖劑為100 mM的磷酸鹽時，見圖(b)，即使只進樣5 μL，也會讓流動相中產生pH值到6的區(qū)域。
在色譜柱出口端：
我們可以看到其最大的pH值比色譜柱入口端監(jiān)測的數(shù)據(jù)要低，這應該主要和樣品的稀釋劑的擴散和流動相對其的中和有關。當稀釋劑中的緩沖劑濃度為1 mM時，如圖C，樣品稀釋劑在色譜柱中充分擴散和被中和，監(jiān)測到色譜柱后的pH基本都低于4，除非進樣量達到100 μL時，才有少量的區(qū)域pH高于4;而當樣品稀釋劑濃度為100 mM時，如圖6D，當進樣量為15 μL，30 μL和100 μL，會讓色譜柱中很大的區(qū)域的pH都大于5。
而苯甲酸的pKa為4.2，當色譜柱中的pH值由流動相的3.2升高時，讓苯甲酸的電離程度也提高，從而讓其保留時間降低，當pH值的變化比較劇烈時(如稀釋劑的磷酸鹽濃度為100 mM，進樣量為15 μL或30 μL)，色譜峰的保留時間顯著減少，同時峰的拖尾變得更加嚴重，而當進樣量為100 μL時，色譜峰會出現(xiàn)嚴重的變形和裂分現(xiàn)象，如圖7。
圖7 進樣不同的稀釋劑時樣品峰的疊加圖
綜合圖6和圖7可以看出，分析物的出峰行為和稀釋劑對流動相pH的影響情況出現(xiàn)了非常強的相關性。我們可以看到當稀釋劑與流動相的pH不匹配時，特別在稀釋劑中緩沖液的緩沖能力比較強、進樣量比較大的時，對于pKa在特定范圍內的分析物的出峰行為產生不可忽視的影響。相對應的，降低稀釋劑的緩沖能力、減少進樣體積以及讓稀釋劑對流動相pH的影響范圍盡量避開所關注的分析物的pKa都是有效的方向。
